ردیابی اختصاصی Phytopthora inundata از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ساده و تودرتو

نوع مقاله: مقاله کامل پژوهشی

نویسنده

نویسنده و مسئول مکاتبه

چکیده

گونة  Phytophthora inundataبه تازگی توصیف شده و به علت خصوصیات ریخت‌شناختی و حداکثر دمای رشد غیرعادی، شناسایی آن دشوار است. این گونه با سایر گونه‌های بیمارگر گیاهی جنس Phytophthoraکه بدون پاپیل و گرماپسند هستند، اشتباه می‌شود. در این بررسی برای شناسایی P. inundataشیوه‌ای براساس واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ساده و تودرتو ابداع شد. بدین منظور مجموعه‌ای از جدایه‌ها مربوط به میزبان‌های مختلف که نمایندة تنوع موجود در توالی نواحی رمزگذار و فاقد رمزِ این گونه بودند، مورد بررسی قرار گرفت. براساس توالی‌های جداکنندة نسخه‌برداری شدة داخلی یک و دو و ژن 8/5 اس مربوط به دی‌اِن‌اِی ریبوزومی (آی‌تی‌اِس)، ژن پروتئین مقاوم به شوک حرارتی 90، ژن‌های پروتئین پیوستة تریوزفسفات ایزومراز/گلیسرآلدئید سه فسفات دی هیدروژناز و هم‌چنین ژن پروتئین 60 اس ریبوزومی ال 10، برای گونة مذکور ده عدد آغازگرِ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اختصاصی طراحی گردید. برای ایجاد بیشترین اختصاصیت و کارآیی، دمای جفت‌شدگی و زمان گسترش برای هر جفت آغازگر بهینه‌سازی گردید. برای ارزیابی آغازگرها از 28 گونة دیگر فیتوفتورا که از نظر ریخت‌شناختی و مولکولی تأیید شده بودند، استفاده شد. در اغلب موارد هیچ‌یک از مجموعه آغازگرها قادر به فزون‌سازی دی‌اِن‌اِی خالص‌سازی شده از گونه‌های Phytophthora غیرخودی نبودند. واکاوی‌ها نشان داد که بهترین نامزد برای شناسایی جدایه‌های P. inundata مجموعة ITS-I1 می‌باشد که از ترکیب آغازگرهای ITS-IF1 و ITS-IF2 تشکیل شده است. دمای جفت‌شدگی بهینه برای این مجموعه 69 درجة سانتی‌گراد و بهترین زمان گسترش 40 ثانیه می‌باشد. به نظر می‌رسد استفاده از واکنش زنجیره‌ای تودرتو با استفاده از مجموعة ITS-I1 به همراه آغازگرهای عمومی ITS4 و ITS6 به عنوان آغازگرهای خارجی حداقل 50 برابر حساس‌تر از روش سنتی است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

SPECIES-SPECIFIC DETECTION OF Phytophthora inundata BY SIMPLE AND NESTED-PCR

نویسنده [English]

  • R. MOSTOWFIZADEH-GHALAMFARSA‌
چکیده [English]

Phytophthora inundata has been recently described and depicted as a ‘difficult’ taxon for identification due to its morphology and unusually high upper temperature limit for growth which has been mistaken for other non-papillate and high temperature tolerant plant pathogenic Phytophthora species. A simple as well as a nested-PCR based method was developed for the identification of P. inundata. A collection of isolates from different hosts representing diversity of species were examined for unique regions of coding as well as non-coding gene sequences. Based on internal transcribed spacers 1, 2 and 5.8S gene of rDNA (ITS), heat shock protein 90 gene (HSP), triosephosphate isomerase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase fusion protein (TIG), and 60S ribosomal protein L10 gene (RPL) ten PCR primers specific for P. inundata were designed. Annealing temperatures and extension times were optimized for each set of primers for maximum specificity and efficiency. To evaluate the specificity of the method, 28 morphologically and molecularly characterized Phytophthora species were tested. In most cases neither set of primers amplified purified DNA from these non-homologous Phytophthora species. Analysis showed that the best candidate for identification of P. inundata isolates is ITS-I1 set which is a combination of ITS-IF1 and ITS-IR1. The optimized annealing temperature for this set was 69 °C and the best extension time was 40 sec. It seems that nested-PCR by ITS-I1 set together with universal ITS6 and ITS4 as external primers is at least 50 times more sensitive than conventional PCR.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Phytophthora inundata
  • Oomycota
  • internal transcribed spacer of rDNA (ITS)
  • identification
  • Detection