اکراتوکسینA و جدایه‌های مولد اکراتوکسینA در گروه Aspergillus section Nigri در کشمش ایران *

نوع مقاله: مقاله کامل پژوهشی

نویسنده

نویسنده

چکیده

اکراتوکسین A (OTA) زهرابه قارچی است که عمدتاً توسط گونه‌هایAspergillus و Penicillium در غلات، کشمش و قهوه تولید می‌شود. مهم‌ترین عامل محدودکننده صادرات کشمش و قهوه در دنیا آلودگی این محصولات به اکراتوکسینA است. سمیت ناشی از اکراتوکسین Aدر کلیه‌ها بروز می‌کند و سبب نارسایی و نهایتاً سرطان کلیه‌ها و کبد می‌شود. در این تحقیق از محصول کشمش استان خراسان (کاشمر، خلیل آباد، قوچان)، استان قزوین (تاکستان)، و استان آذربایجان شرقی (بناب، مراغه و ملکان) نمونه‌برداری شد. جهت جداسازی قارچ‌های گروه Aspergillus Sec. Nigri نمونه‌های کشمش مستقیماً در محیط‌های کشت مصنوعی مناسب کشت شد، هم‌چنین سوسپانسیونی از آلودگی‌های سطحی آنها تهیه، در محیط مناسب کشت و قارچ‌های گروه فوق ردیابی، تشخیص و میزان آلودگی نمونه‌ها ثبت گردید. اکراتوکسینA  در نمونه‌های کشمش جمع‌آوری شده با استفاده از روش HPLC+IACردیابی و میزان آن اندازه‌گیری شد. جهت ارزیابی توانایی توکسین زایی جدایه‌های گروه Aspergillus Sec. Nigri حاصل از کشمش، چهارده جدایه انتخاب و میزان اکراتوکسین تولید شده توسط آنها در محیط PDB اندازه‌گیری گردید. جدایه‌هایی از گونه A. carbonariusکه بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک تشخیص شده بودند، انتخاب،  دی ان ای آنها استخراج و نواحی 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S از دی ان ای ریبوزومی و ژن بتا توبولین آنها در واکنش PCR تکثیر، تعیین توالی، و با توالی این نواحی در سایر جدایه‌های گزارش شده از این گونه در NCBI مقایسه شد. همگی نمونه‌ها (44 نمونه) به قارچ‌های گروه A. Sec. Nigri آلوده بودند، لیکن میزان آلودگی بین 8- 100 درصد متغیر بود. بیشترین آلودگی قارچی (100%) مربوط به کشمش‌های آسیب دیده و کشمش‌هایی بود که مصارف مستقیم خوراکی نداشتند. آلودگی به اکراتوکسین A در پنج نمونه کشمش (11% نمونه‌ها) با گستره آلودگی ppb 4/0 تا ppb 100 ردیابی شد. از بین 52 جدایه متعلق به گروه A. Nigri تعداد 10 جدایه (20%) متعلق به گونه A. carbonariusبود که 71% جدایه‌های مورد بررسی توانایی تولید اکراتوکسین A در مقادیر  3/2 تا  ppb8/108 در محیط مصنوعی را داشتند. توالی نوکلئوتیدی دی ان ایریبوزومی و ژن بتا توبولین نماینده‌هایی از جدایه‌های A. carbonarius کشمش که مولد مقادیر بالای اکراتوکسین A بودند، همگی یکسان و با جدایه‌های این قارچ در بانک ژن 100% تشابه داشت که با شماره‌های دسترسی KF434631، KF434632،  KF434633  برای دی ان ایریبوزومی وKF434634 ، KF434635 برای ژن بتا توبولین در بانک ژنNCBI  ثبت شد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

OCHRATOXIN A AND OCHRATOXIN - PRODUCING ISOLATES OF ASPERGILLUS SECTION NIGRI IN RAISIN IN IRAN

نویسنده [English]

  • M. MIRABOLFATHY
چکیده [English]

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin which contaminates different plant products, including cereals, coffee, and dried grape. Aspergillus and penicillium species were identified as the main producer of OTA. Ochratoxin A is a potent nephrotoxin. The presence of OTA in raisin is an important barrier to raisin export. The maximum tolerable level of OTA in raisin is 10 µg /kg. During 2010- 2012 a research was carried out on the monitoring of ochratoxin A and ochratoxin A - producing fungi in raisin of Khorasan, Azarbaijan, and Qazvin provinces. The samples were collected from different processing stages of raisin, storages and factories. To study fungal contamination two methods of plating surface disinfected raisin and washing of raisin surface (suspension) on artificial media were used. Aspergillus section Nigri species were isolated and the growth of Aspergillus section Nigri species which were assumed to produce ochratoxin A were recorded after incubation period. To confirm morphological identification of A. carbonarius isolates, DNA of three A. carbonarius isolates were extracted and their ITS regions of ribomal DNA and β- tubulin genes were amplified by PCR and sequenced. Ochratoxin A contaminations of the raisin samples were estimated using HPLC- IAC method. To study ochratoxin A producing ability of Aspergillus section Nigri species isolated from raisin, 14 isolates selected as representative were cultured on PDB medium and OTA produced by each isolate was evaluated using HPLC- IAC method. All raisin samples were contaminated by Aspergillus section Nigri species. The mean of the assumed ochratoxin A producing -fungi contamination of raisin samples was 56.31 (8-100%) but varied depending on the processing method, raisin variety and location. The highest contamination was found in injured not directly edible raisin. Twenty percent of the isolates belonged to A. carbonarus species and the rest to A. nigra. Ochratoxin A was found in five samples out of 44 (11%) raisin samples at the contamination  levels of 0.4 to 100 ng/g. 71% of tested A. carbonarius isolates produced ochratoxin between 0.78- 108.8 ppb. DNA sequencing data were generated for a part of 18S-ITS1-5.8S-ITS2 and 28S region of the rDNA, and β- tubulin gene region. These sequences were compared to other sequences of A. carbonarus in GenBank and showed 100 % and 99% similarity, respectively.  These data confirmed the morphological examinations. Sequences were submitted to GenBank under the accession numbers KF434631, KF434632, and KF434633 for ITS, and KF434634 ، KF434635 for β- tubulin gene. Since the highest contamination was found in injured raisins, they can be easily removed to reduce contamination by fungi and ochratoxin.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Raisin
  • Iran
  • Ochratoxin
  • Aspergillus carbonarius