شناسایی عامل لکه برگی پامچال در استان مازندران با استفاده از توالی ژن‌های rpoD و dnak

نوع مقاله: گزارش کوتاه

نویسندگان

نویسنده

چکیده

بیماری لکه برگی ناشی از گونه‌ای زانتوموناس در پامچال وحشی (Primula vulgaris) در چند منطقه جنگلی استان مازندران گزارش شده است (Rahimian. 1995. 12th  Iran. Plant Protec. Cong.,278). براساس یک بررسی ژنومی از تعیین توالی ناحیه ITS و ژن 16s rRNA گزارش گردید که برخی از جدایه‌های عامل لکه برگی پامچال نزدیک به گونه X.campestris می‌باشند (Rahimian et al. 2008. 18th  Iran. Plant Protec. Cong.,420)، ولی اطلاع دقیقی از موقعیت تاکسونومیکی این جدایه‌ها در دسترس نیست. بررسی حاضر به منظور ارزیابی موقعیت تاکسونومیکی جدایه‌های به‌دست آمده از چند منطقه جنگلی استان مازندران انجام گرفت. ازکشت نمونه‌های پامچال دارای علایم لکه برگی، جدایه‌هایی با کلنی‌های محدب زرد رنگ و لعابدار روی محیطNAS  به‌دست‌آمد. واکنش فوق حساسیت پس از تزریق سوسپانسیون باکتری به برگ‌های شمعدانی بعد از 24 ساعت و بیماری‌زایی روی برگ‌های پامچال پس از 7 تا 14 روز به اثبات رسید. نقوش الکتروفورزی پروتئین‌های سلولی اختلاف چندانی میان جدایه‌ها نشان نداد. از نظر ویژگی‌های فنوتیپی جدایه‌ها بسیار شبیه هم بوده و فقط در مصرف اسید سیتریک به عنوان منبع کربن اختلاف نشان دادند. DNA ژنومی جدایه‌ها استخراج و با به‌کارگیری آغازگرهای  dnakو rpoD قطعاتی از این دو ژن با PCR در شرایط توصیه شده پارکینسون و همکاران (Parkinson et al. 2007. Int. J. Syst. Evol. MicrobioI. 57:2881-2887) ولی با کاهش دمای مرحله اتصال (Annealing) تکثیر شد. محصول PCR در ژل آگارز 1% الکتروفورز و ژل در محلول ژل رد(gel red) رنگ‌آمیزی شد. به‌ترتیب دو قطعه 965 و736 bp از ژن‌های  dnakو rpoDتکثیر گردید. به منظور امکان تفکیک محصولPCR  جدایه‌ها از یکدیگر هضم محصول حاصل از تکثیر ژن‌های dnak وrpoDبا آنزیم  BamHIصورت گرفت. از ضریب تشابه جاکارد برای تعیین تشابه جدایه‌ها و از روش  UPGAMAو نرم‌افزار NTSYS برای آنالیز خوشه‌ای استفاده شد. نمونه‌های انتخاب شده براساس نتایج RFLP، توالی‌یابی شد. توالی نوکلئوتیدی به‌دست آمده، پس از همردیف‌سازی چندگانه (Multiple sequence alignment) با برنامه MEGA4 با سایر توالی‌های مربوط به این ناحیه در گونه‌های مختلف Xanthomonas موجود در ژن بانک (NCBI) مقایسه شدند. نتایج به‌دست آمده نشان داد جدایه‌ها درسطح تشابه 98% با گونه Xanthomonas hortorum شباهت داشته و احتمالاً به پاتوار گزارش نشده‌ای از این گونه تعلق دارند. این اولین گزارش از جدایه‌هایی از گونه X.hortorum به عنوان عامل بیماری لکه برگی در پامچال است.

عنوان مقاله [English]

IDENTIFICATION OF THE CAUSAL AGENT OF A LEAF SPOT OF PRIMULA BY DNAK AND RPOD GENE SEQUENCES IN MAZANDARAN

نویسندگان [English]

  • M. AGHASI NEJAD
  • H. RAHIMIAN
  • M. TOHIDFAR
چکیده [English]

A leaf spot disease caused by strains of Xanthomonas in wild primrose (Primula vulgaris) were reported in several forest locations of Mazandaran (Rahimian. 1995. 12th  Iran. Plant Protec. Cong. P. 278). Based on a genomic study of ITS area and 16S rRNA gene sequencing, it was reported that some isolates causing leaf spot of P. vulgaris probably belong to X. campestris (Rahimian et al. 2008. 18th  Iran. Plant Protec. Cong. P. 420). but there is insufficient information available on the taxonomical status of these isolates. The present study wase performed to evaluate the taxonomic position of the isolates obtained from several forest areas of Mazandaran province. Yellow-pigmented٫ round and convex Xanthomonas-likecolonies were isolated from the diseased plants. Hypersensitive reaction(HR) after 24 hours injection of bacterial suspension to geranium leaves and pathogenicity on P. vulgaris leaves after 7 to 14 days were proven. Only slight differences were observed among the electrophoretic pattern of cell proteins of the strains. Strains were very similar phenotypically and differed mainly in utilization citrate as carbon soure for growth. Genomic DNA of isolates was extracted and PCR was done under previously described conditions (Parkinson et al. 2007. Int. J. Syst. Evol. MicrobioI. 57:2881-2887) reducing the annealing temperature. Products were electrophoresed in %1 gel and the gel was stained with gel red solution. Using dnak and rpoD primers fragments 965 and 736 bp in size٫ were amplified in PCR٫ respectively. For differentiation of the isolates٫ the PCR products were digested with BamHIand electrophoresed on acrylamid gel. Dendrograms were constructed using the data sets obtained after digestion of dnak and rpoD amplified fragments with the restriction enzyme, using the Jaccard coefficient, the UPGMA algorithm and the NTSYS-PC program. Selected samples were sequenced based on RFLP results. The nucleotide sequence obtained٫ after multiple sequence alignment٫ were compared٫ with MEGA version 4.0٫withother sequences to various Xanthomonas species present in the Gene Bank(NCBI). Results٫ showed that isolates resembled٫ at 98% similarity٫ with strains of Xanthomonas hortorum deposited in GeneBank٫ but probably belong to a pathovar distinct from the existing ones in this spesies. This is the first report of Xanthomonas hortorum causing a leaf spot diseaseon Primula .